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首頁-技術文章-【CEM】環狀二硫鍵橋肽的全自動合成

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【CEM】環狀二硫鍵橋肽的全自動合成

更新時間:2024-09-03       點擊次數:1337

一、引言

含有二硫鍵的環肽代表了一類具有廣泛生物功能的化合物,其功能范圍從毒素到重要的激素。1二硫鍵有助于穩定肽的二級結構和構象,這有利于提高蛋白水解穩定性和目標親和力。2由于它們具有潛在的治療價值,對合成含二硫鍵橋連的環肽的興趣穩步增長。通過使用正交保護的半胱氨酸氨基酸,如Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OHFmoc-(S)-Cys(STmp)-OH(圖1),可以制備含有二硫鍵的肽。Cys(Mmt)基團可以使用稀釋的三氟乙酉夋(TFA)溶液選擇性去保護,而Cys(STmp)基團則使用二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑進行正交去保護。去保護后,使用N-氯琥珀酰亞胺(NCS)作為溫和氧化劑,可以選擇性氧化Cys巰基形成二硫鍵。3

在這里,我們報告了使用Liberty BlueTM微波肽合成器全自動合成良好純度的含二硫鍵橋連的環肽。一個骨形態發生蛋白受體激活素樣激酶3 (Alk3)的肽激動劑THR-1234,在3小時內完成合成,純度為77%。最后,一種含有兩個二硫鍵的錐蝸牛毒素肽(Conotoxin-SI5在不到4小時內合成,純度為67%。將微波能量應用于二硫鍵橋連肽的合成可以實現更高效的偶聯,從而快速合成并達到高純度(CarboMAXTM)。6

【CEM】環狀二硫鍵橋肽的全自動合成

1. 左:Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH;右:Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH


二、實驗部分

HE-SPPS材料和方法:所有肽都是在CEM Liberty Blue™自動微波肽合成器上合成的,使用的是Rink Amide ProTide™ LL樹脂(0.19 mmol/g替換)或Cl-MPA ProTide™ LL樹脂(0.18 mmol/g替換)。使用DMF進行后去保護洗滌,然后采用DIC/Oxyma活化方法進行偶聯。肽樹脂在CEM Razor®肽裂解系統上用TFA/TIS/H2O/DODT92.5/2.5/2.5/2.5)裂解。肽在冷乙酉迷中沉淀,粗品在分析前進行凍干。

分析:粗肽在配備了Acquity UPLC BEH C8柱(1.7 μm, 2.1 x 100 mm)的Waters Acquity UPLC系統上進行分析,該系統裝有PDA檢測器。UPLC系統連接到Waters 2100單四級桿MS用于結構測定。峰分析是在Waters MassLynx軟件上完成的。分離是通過(i)水中的0.05% TFA和(ii)乙腈中0.05% TFA的梯度洗脫進行的。


三、結果和討論

A)合成THR-123CYFDDSSNVLCKKYRS-CO2H

選擇THR-123(圖2)來展示含有C端酸的單一二硫鍵橋連肽的合成。該肽在10 µmol規模上使用Cl-MPA ProTide™ LL樹脂(0.18 mmol/g替換)進行合成。第一個氨基酸使用CEM之前報道的氯化物加載循環自動加載。所有其他氨基酸循環使用1分鐘/90oC去保護和一次2分鐘/90oCDIC/Oxyma偶聯(使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C)。使用2% TFADCM溶液進行Cys(Mmt)的去保護。反應在室溫下進行1分鐘,重復五次。使用25 mMNCSDMF溶液實現二硫鍵的形成。反應在室溫下進行15分鐘。在Liberty Blue自動微波肽合成器上進行的THR-123的微波增強SPPS產生了77%純度的目標肽(圖3)。


【CEM】環狀二硫鍵橋肽的全自動合成

2.THR-123


【CEM】環狀二硫鍵橋肽的全自動合成

3. THR-123UPLC色譜圖


B) 合成Conotoxin-SIICCNPACGPKYSC-NH2

選擇Conotoxin-SI(圖4)來展示含有兩個二硫鍵的環肽的合成。該肽在10 µmol規模上使用Rink Amide ProTide™ LL樹脂(0.19 mmol/g替換)進行合成。所有氨基酸循環使用1分鐘/90oC去保護和一次2分鐘/90oCDIC/Oxyma偶聯(使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C;使用Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH用于C)。使用2% TFADCM溶液進行Cys(Mmt)的去保護。反應在室溫下進行1分鐘,重復五次。使用25 mMNCSDMF溶液實現二硫鍵的形成。反應在室溫下進行15分鐘。使用5% DTT + 0.1 M NMMDMF溶液進行Cys(STmp)的去保護。反應在室溫下進行5分鐘,重復三次。最后,使用25 mM NCSDMF溶液形成第二個二硫鍵(室溫下15分鐘)。在Liberty Blue自動微波肽合成器上進行的Conotoxin-SI的微波增強SPPS產生了67%純度的目標肽(圖5)。

【CEM】環狀二硫鍵橋肽的全自動合成

4.Conotoxin-S


【CEM】環狀二硫鍵橋肽的全自動合成

5. Conotoxin-SIUPLC色譜圖


【CEM】環狀二硫鍵橋肽的全自動合成


四、結論

采用全自動快速合成技術,我們成功高效地完成了含二硫鍵橋接的環肽的合成,并且實現了較高的純度。借助CarboMAX™6化學技術,偶聯效率得到了顯著提升,這不僅極大縮短了合成時間,還確保了產物的高純度。例如,一個C端帶有羧酸的環狀二硫鍵橋接肽——THR-123,在短短不到3小時的時間內就被迅速合成出來,且純度達到了77%。相比之下,傳統的室溫合成方法通常需要長達20小時來合成包含兩個二硫鍵的Conotoxin-SI。3而利用微波增強的固相肽合成技術(SPPS),在不到4小時內就制備出了純度為67%的相應肽。


引用

1 Góngora-Benítez, M.; Tulla-Puche, J.; Albericio, F. Chem. Rev. 2014, 114 (2), 901–926.

2 Adessi, C.; Soto, C. Curr. Med. Chem. 2002, 9 (9), 963–978.

3 Postma, T. M.; Albericio, F. Org. Lett. 2013, 15 (3), 616–619.

4 Sugimoto, H.; LeBleu, V. S.; Bosukonda, D.; Keck, P.; Taduri, G.; Bechtel, W.; Okada, H.; Carlson, W.; Bey, P.; Rusckowski, M.; Tampe, B.; Tampe, D.; Kanasaki, K.; Zeisberg, M.; Kalluri, R.; Kalluri, R. Nat. Med. 2012, 18 (3), 396–404.

5 Azam, L.; McIntosh, J. M. Acta Pharmacol. Sin. 2009, 30 (6), 771–783.

6 CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature."

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