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首頁-技術文章-【CEM】Fmoc-His(Boc)-OH在基于Fmoc的固相肽合成中的應用

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【CEM】Fmoc-His(Boc)-OH在基于Fmoc的固相肽合成中的應用

更新時間:2024-08-06       點擊次數:1991

一、組氨酸的差向異構化

對映體純度極大地影響肽的生物活性;因此,避免D-異構體含量的增加至關重要。1在固相肽合成(SPPS)的偶聯過程激活階段,組氨酸特別容易發生差向異構化。組氨酸傾向于差向異構化(圖1)是一種分子內的副反應,這是由于咪唑Nπ上的孤對電子與酸性α碳氫的接近性所導致。當氨基酸被激活時,1號位的孤對電子具有足夠的堿性以進行去質子化,從而形成一個無立體選擇性的酯烯醇鹽22


此時,轉化為L-D-異構體3并沒有熱力學上的優先途徑。當反應位點聚集,且組氨酸在激活狀態保持較長時間的期間,差向異構化的可能性增加。

【CEM】Fmoc-His(Boc)-OH在基于Fmoc的固相肽合成中的應用





1Fmoc-His(PG)-OH在激活過程中高差向異構化水平的機制解釋


二、組氨酸側鏈保護

對咪唑環的保護(圖2)通常采用在Nτ位置使用三苯甲基(Trt)基團的方式實現4Trt基團因其體積大和具有吸電子性,能夠有效抑制諸如環上N-酰化等副反應,然而在控制差向異構化方面效果有限。其他側鏈保護基團,尤其是那些提供Nπ保護的,例如Fmoc-His(π-Mbom)-OH5),通過阻斷α-氫的接觸途徑來減少差向異構化。但這些衍生物的缺點在于它們本身的高成本和因多步驟合成策略導致的低批量供應,這種策略需要在連接Mbom基團時對Nα位置進行互斥保護。3,4,5,6此外,在肽切割過程中還需添加額外的清除劑,以防止新暴露的氨基功能團上發生羥甲基化。


本文中,Fmoc-His(Boc)-OH6)被證實是Fmoc SPPS中組氨酸并入的寶貴替代物,因為它在高溫下對差向異構化具有較高的穩定性,成本低,且比其他任何市場上可購買的衍生物具有更好的批量供應能力。





【CEM】Fmoc-His(Boc)-OH在基于Fmoc的固相肽合成中的應用

圖2:Fmoc-SPPS用的組氨酸衍生物:Fmoc-His(Trt)-OH(4),Fmoc-His(π-Mbom)-OH(5)和Fmoc-His(Boc)-OH(6)



三、Fmoc-His(Boc)-OH的優勢

Fmoc-His(Boc)-OH 能夠以游離酸和環己胺(CHA)鹽的形式大量購買。對于鹽形式,需要通過提取過程來移除CHA基團。鑒于這一過程相對繁瑣,我們的研究便專注于游離酸的應用。根據先前的報告,與His(Trt) 相比,His(Boc)在差向異構化方面的傾向性更低。7這一現象可以歸因于氨基甲酸酯基團較強的吸電子效應,它有效地從π子中抽取電子云密度,從而降低了其堿性。


四、討論

一項采用利拉魯肽和1-42Beta淀粉樣蛋白的可行性研究評估了-Boc基團在微波(MW)輔助固相肽合成(SPPS)過程中對差向異構化的抑制效果及側鏈的穩定性。肽段是在HE-SPPS條件下制備的,具體操作包括1分鐘90°C的去保護和2分鐘90°C使用DIC和Oxyma Pure進行的偶聯。8與基于尿嘧啶的激活策略相比,DIC/Oxyma Pure激活在偶聯效率和抑制差向異構化方面提供了更優的結果。后者的表現歸因于碳二亞胺活化所固有的酸性環境。9,10在室溫或稍高的條件(例如50°C)下并入組氨酸能進一步降低D-異構體的形成,但這樣的條件對于His(Trt)仍然不夠理想。我們比較了His(Trt)和His(Boc)在使用兩種常見協議時的偶聯條件:(1)10分鐘50°C和(2)2分鐘90°C。最后,我們研究了溶液中的穩定性,以確定其在Liberty BlueTM HT12上的高通量自動化應用的可行性。

【CEM】Fmoc-His(Boc)-OH在基于Fmoc的固相肽合成中的應用

利拉魯肽的合成

利拉魯肽具有一個N端的組氨酸,這在與肽鏈的偶聯中存在一定難度,因此,通過微波加熱來增強酰化作用是有益的。使用三苯甲基保護在50°C下偶聯組氨酸10分鐘,結果顯示D-異構體的形成增加到了6.8%(如表1所示)。在相同條件下,Fmoc-His(Boc)-OH顯著減少了差向異構化,僅為0.18%


Fmoc-His(Boc)-OH90°C時的表現也相當出色,觀察到的差向異構化水平為0.81%,相比之下His(Trt)則大于16%Fmoc-His(Trt)-OHFmoc-His(Boc)-OH都以相當的粗純度獲得了目標肽(圖3)。Fmoc-His(π-Mbom)-OH在純度和D-His方面提供了與Fmoc-His(Boc)-OH相似的結果。

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3:使用(a) Fmoc-His(Trt)-OH(b) Fmoc-His(Boc)-OH的利拉魯肽UPLC色譜圖。組氨酸偶聯條件 = 50°C10分鐘。總合成時間 = 2小時55分鐘









1:利拉魯肽中組氨酸在不同偶聯條件下的D-異構體形成情況

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1-42Beta淀粉樣的合成

之前的研究表明,在長時間的哌啶處理過程中,Nτ-Boc側鏈基團顯示出不穩定性。11為了測試高溫去保護過程中–Boc的穩定性,我們合成了包含三個組氨酸殘基的1-42Beta淀粉樣蛋白。1-42Beta淀粉樣蛋白的合成序列是出了名的困難,需要使用特殊的偶聯試劑,即使在嚴苛條件下,產物純度通常也過低,無法進行分析和純化。12與常規合成方法不同,HE-SPPS即便在未優化的條件下也能獲得木及高的粗純度。我們比較了His(Trt)His(Boc)50°C下偶聯10分鐘以及90°C下偶聯2分鐘的情況。His(Boc)將總合成時間從4小時24分鐘縮短到3小時58分鐘,并且將差向異構化的比例從2.88%降低至1.29% D-異構體(表2)。UPLC分析表明,這兩種合成方法得到的目標產物在粗純度上具有可比性(圖4)。

2BAHis(Trt)His(Boc)的差向異構化情況

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4:使用(a) His(Trt)(b) His(Boc)1-42 Beta淀粉樣蛋白的UPLC色譜圖



溶液中的穩定性


在自動化高通量SPPS應用中,要求底物能在溶液中保持溶解狀態長達10天。通常,像組氨酸這樣的反應物由于保護基團的降解/丟失而導致變色和沉淀,其溶液壽命僅限于5天。在這項研究中,我們測試了組氨酸溶液(DMF0.2 M)在大氣條件下存放10天的穩定性(圖5)。所有樣品都迅速溶解,得到無色溶液。Fmoc-His(Trt)-OH的變色在短短24小時內就開始出現,并在10天的時間里加劇。10天后,Fmoc-His(π-Mbom)-OH溶液略呈黃色,而Fmoc-His(Boc)-OH溶液在研究期間保持無色。UPLC分析表明,Fmoc-His(Boc)-OHFmoc-His(π-Mbom)-OH保持了>99%的純度。基于強烈的變色,預計在10天的研究期間Fmoc-His(Trt)-OH樣品中形成了幾種雜質(圖6)。然而,使用質譜對這些雜質進行定性未能成功。


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5:不同組氨酸衍生物溶液中的穩定性顏色測試

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6. 10天后DMF中組氨酸衍生物(0.2 M)UPLC分析;(a) = Fmoc-His(Trt)-OH (b) = Fmoc-His(π-Mbom)-OH (c) = Fmoc-His(Boc)-OH


五、結論

上述數據表明,His(Boc)是一種強大的組氨酸衍生物,可以在90°C下高效偶聯,提供優良的粗純度,同時縮短偶聯時間并顯著降低差向異構化。與其他抑制差向異構化的N保護衍生物相比,Fmoc-His(Boc)-OH更易獲得,同時保持相當的合成性能。總之,Fmoc-His(Boc)-OH的核心優勢包括:

商業批量可用性強,價格相對于Fmoc-His(Trt)-OH更具競爭力

在高溫下具有低水平的差向異構化;50°C及以下的偶聯溫度使得Fmoc-His(Boc)-OH適用于活性藥物成分的合成,無需復雜的偶聯試劑和條件13

優異的溶液穩定性;與Fmoc-His(π-Mbom)-OH相當,且優于Fmoc-His(Trt)-OH


六、材料與方法

試劑

以下Fmoc氨基酸和樹脂購自位于MatthewsNCCEM公司,包含所示的側鏈保護基團:Ala, Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Gln(Trt), Gly, His(Boc), His(Trt), Ile, Leu, Lys(Boc), Lys(palmitoyl-Glu-OtBu), Phe, Pro, Ser(tBu), Tyr(tBu), ValRink Amide ProTideTM LL, Cl-MPA ProTideTM LL, 以及Fmoc-Gly Wang PS LL樹脂也購自CEM公司。二異丙基碳二亞胺(DIC),哌啶,三氟乙酉夋(TFA),3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇(DODT)和三異丙基硅烷(TIS)購自Sigma-AldrichSt. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM),N,N-二甲基甲酰胺(DMF),無水二乙酉迷(Et2O),乙酸,高效液相色譜級水,以及乙腈購自VWRWest Chester, PA)。液相色譜-質譜級水(H2O)和液相色譜-質譜級乙腈(MeCN)購自Fisher ScientificWaltham, MA)。D-異構體通過手性GC-MSC.A.T. GmbH)進行測定。

肽合成:利拉魯肽

CEM Liberty Blue自動化微波肽合成器上,以0.10 mmol的規模合成了該肽。使用了0.313Fmoc Gly Wang PS LL樹脂(0.32 meq/g置換)。去保護作用采用20%哌啶和0.1 M Oxyma PureDMF中執行。偶聯反應使用5倍過量的0.2 M Fmoc-AA1.0 M DIC1.0 M Oxyma PureDMFCarboMAX)中進行。切割則應用CEM Razor™高通量肽切割系統,配比為92.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT。切割后,肽通過Et2O沉淀并過夜凍干。

肽合成:1-42Beta淀粉樣蛋白

采用CEM Liberty Blue自動化微波肽合成器,以0.10 mmol的規模在0.512g Cl-MPA ProTide樹脂(0.19 meq/g置換)上合成了該肽。去保護作用使用20%哌啶和0.1 M Oxyma PureDMF中進行。偶聯反應用5倍過量的0.2 M Fmoc-AA1.0 M DIC1.0 M Oxyma PureDMFCarboMAX)中進行。切割采用CEM Razor™高通量肽切割系統,配比為92.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT。切割后,肽通過Et2O沉淀并過夜凍干。

穩定性研究

50毫升離心管中,制備了0.2摩爾濃度的組氨酸溶液(總共5毫升DMF),并對管進行了密封。這些溶液在實驗室環境下保持在室溫,持續10天。為了準備用于超高效液相色譜-質譜分析的樣品,將10微升的組氨酸溶液稀釋到5毫升的50/50(體積比)乙腈和水的混合溶劑中。調整進樣量,直至吸光度達到35 – 55單位。

七、參考文獻

(1) Kusumoto, S.; Matsukura, M.; Shiba, T. Biopolymers, 1981, 20,1869 --1875.

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(3) Colombo, R.; Colombo, F.; J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1984, 0, 292 – 293. Mergler, M.; Dick, F.; Sax, B.; Schwindling, J.; Vorherr, Th. J. Pept. Sci. 2001, 7, 502 – 510.

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(9) Patent: US20160176918

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(13) Bacem Application Note. Mergler, M.; Dick, F.; Vorherr, Th. Methods for Fmoc-His(Trt)-OH Resulting in Minimal Racemization.

(14) CEM Technical Note (P/N: 600837) - “Cl-MPA ProTide and Cl-TCP(Cl) ProTide Resin Loading and Protected Cleavage Procedures.


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